Penelitian ini bertujuan menganalisis pengaruh budaya organisasi dan rotasi pekerjaan terhadap motivasi kerja dan kinerja pegawai Puskesmas di Kota Tarakan. Jenis penelitian eksplanatori dengan pendekatan kuantitatif. Jumlah populasi 215 orang dan sampel adalah 85 orang. Pengumpulan data dengan menyebar kuesioner dan dianalisis dengan path analysis. Hasil pengujian hipotesis dibuktikan budaya organisasi memiliki pengaruh yang signifikan pada motivasi kerja pegawai Puskesmas di Kota Tarakan, hal ini mengindikasikan setiap ada perubahan budaya organisasi yang lebih baik akan memberikan dampak positif terhadap keinginan pegawai lebih semangat dalam bekerja. Rotasi pekerjaan memiliki pengaruh yang signifikan pada motivasi kerja pegawai, dengan hal ini mengindikasikan setiap kebijakan rotasi pekerjaan dapat dilakukan dalam setiap periode tertentu maka memberikan dapat pada pegawai lebih terdorong untuk bekerja lebih giat lagi karena dengan posisi baru akibat dari rotasi tersebut. Budaya organisasi memiliki pengaruh secara langsung dan signifikan pada kinerja pegawai, hal ini mengindikasikan setiap ada peningkatan budaya organisasi yang sudah ada akan memberikan dampak positif terhadap kinerja pegawai. Rotasi pekerjaan secara langsung memiliki pengaruh yang signifikan terhadap kinerja pegawai, hal ini mengindikasikan kebijakan rotasi pekerjaan sering dilakukan dan penempatan yang tepat dapat meningkatkan kinerja pegawai. Motivasi kerja memiliki pengaruh yang signifikan terhadap kinerja pegawai, hal ini diindikasikan bertarnbah tinggi motivasi kerja pegawai akan meningkatkan kinerjanya, demikian juga sebaliknya. Pengaruh secara langsung antara budaya organisasi dan rotasi pekerjaan terhadap kinerja pegawai lebih besar dari pada pengaruh tidak langsung antara budaya organisasi dan rotasi pekerjaan melalui motivasi kerja sehingga pengaruh langsung lebih dominan dibanding pengaruh tidak langsung. Motivasi kerja tidak sepenuhnya memediasi secara parsial pengaruh budaya organisasi dan rotasi pekerjaan terhadap kinerja pegawai. Budaya organisasi dan rotasi pekerjaan yang ba.ik serta motivasi yang tetap diawasi pelaksanaannya akan mampu mempengaruhi kinerja pegawai agar lebih baik.